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免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞毒性較高是為何？

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-05　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1478次

　　免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)先吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗?次。更換無(wú)血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液，?滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液-200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液-200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。
　　加?轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(shí)。
　　免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染24h后需要觀察轉(zhuǎn)染過程對(duì)細(xì)胞毒性情況，如果毒性較高，可能是以下原因造成的：
　　1.初期細(xì)胞接種濃度太低。
　　2.轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入量過高，因?yàn)椴煌?xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染的敏感度不同。
　　3.轉(zhuǎn)染后6小時(shí)需更換培養(yǎng)基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。其次，轉(zhuǎn)染后需要對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，比如觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況、qPCR驗(yàn)證或WB檢測(cè)敲減或者過表達(dá)蛋白。
　　4.對(duì)于β-gal表達(dá)載體：可用β-gal染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色并觀察細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞在染色孵育后3-4h即可觀察到，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞則需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。
　　5.對(duì)于GFP表達(dá)載體：熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。如果細(xì)胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達(dá)，表達(dá)太弱的細(xì)胞無(wú)法鏡檢。GFP表達(dá)情況也能使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可加入PI進(jìn)行染色以監(jiān)測(cè)死細(xì)胞情況。
　　若是轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可通過以下兩種方法增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率：
　　1.復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少；
　　2.通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。

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