質粒圖譜為質粒DNA序列的物理圖譜，提供了包括質粒的大小、篩選標記、克隆位點、轉錄及翻譯元件等信息，為我們選擇質粒、了解質粒特點及應用提供了重 要依據(jù)。對于初學者來說該如何去閱讀質粒圖譜呢？今天來給大家講解一下如何閱讀質粒圖譜及構建質粒圖譜。

質粒的組成要素有哪些

1. 復制起始位點：Ori即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
   

2. 抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+。

3. 多克隆位點MCS：克隆攜帶外源基因片段。

4. P/E 啟動子/增強子

5. Terms 終止信號

6. 加poly（A）信號：可以起到穩(wěn)定mRNA作用

如何閱讀質粒圖譜

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）。

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

1.Ampr 水解 β－內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

2.tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。

3.camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

4.neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418（卡那霉素衍生物衍生物）失活。

5.hygr 使潮霉素 β 失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。

它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。

質粒一般只能容納小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。

第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。

這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用哪種載體，還是要以實驗目的為準繩。

啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號

啟動子－促進 DNA 轉錄的 DNA 順序，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。

增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。

核糖體結合位點/起始密碼/ SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。

第六步：質粒圖譜上的箭頭。

 有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

質粒構建以及需要注意的事項：

1.載體構建

 載體構建(vectorconstruction)：載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點（MCS）的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。

 特點：當給質粒插入一段外源DNA片段后，它依然能夠進行自我復制。

2.多克隆位點

 多克隆位點（multiple cloning site, MCS），指的是包含數(shù)個（最多20個）限制性酶切位點（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位，每個限制性酶切位點通常是十分奇特的，即它們在一個特定的載體質粒中只出現(xiàn)一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進行酶切的位點，多克隆位點一般是位于質粒上的一段序列，這段序列含有很多個酶切位點，但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

3.質粒構建

（1）質粒構建原理

質粒構建是分子生物學研究中經常使用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后，將二者連接在一起，再導入宿主細胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內的正確表達。

（2）質粒構建方式

質粒構建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，下面就介紹下T4連接酶構建質粒方法，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接，但一般推薦適用黏性末端。

（3）質粒載體的制備

質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

圖 質粒圖譜

4.一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

   （1）選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太?。?gt;10bp），否則影響限制性內切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切；

    （2）一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

（3）實驗后繼應用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點）。

（4）盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

（5）兩個酶切點至少隔上3個堿基。

（6）兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。

（7）最好使用酶切效率高的酶。

（8）最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

注：質粒構建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。