1、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq DNA聚合酶進行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量為高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模版序列的Tm值最好在72°C左右

Tm值在72°C左右可使復性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值在72°C左右可使復性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T），在Oligo軟件中使用的是最鄰近法（the nearest neighboor method）;

4、引物3'端的堿基一般不用A

引物3'端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。

5、引物3'端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

6、引物3'端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。

7、如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率；

8、引物5'端可以修飾

引物5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

9、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross Dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高(應小于4.5kcal/mol)。否則易導致引物二聚體帶的產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

10、引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3'端AG值較低，而5'端和中間ΔG值相對較高。AG值(自由能)反應了引物與模板結(jié)合的強弱程度，一般情況下，引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3端AG值較低，而5端和中間AG值相對較高。3'端的AG值相對要低，且絕對值不要超過9引物的3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應。

11、引物應在核酸保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線，在各個領域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。