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PEG 介導的雞血細胞融合
發(fā)布時間： 2023-01-12 點擊次數： 1940次簡介
細胞融合的方法有生物法、化學法和物理法?；瘜W法常用的是化學誘導劑聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）結合高 pH、高鈣離子法。該法操作方便，目前已成為人工誘導細胞融合的主要手段。
原理
PEG 介導的細胞融合的基本原理是利用 PEG 使細胞相互接觸部位的膜結構發(fā)生重排，加之膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰質膜在修復時相互合并在一起，導致細胞之間發(fā)生融合。PEG 介導的細胞融合率受下述因素影響。
① PEG 的分子量與濃度：分子量及其濃度與融合率成正比；但分子量越大、濃度越高，對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，常用的 PEG 相對分子質量為 1000～4000，濃度為 40％～60％。
② PEG 的 pH 值：pH 值在 8.0～8.2 之間融合效-率-最-高。
③ 融合時的溫度：由于生物膜的流動性與溫度成正比，在細胞可承受的溫度范圍內適當提高溫度，可提高融合率。
④ 處理時間：處理時間越長，融合率越高，但對細胞的毒害也越大。故一般將處理時間限制在 1.0～1.5 min 之內。若融合后不繼續(xù)培養(yǎng)，可將處理時間延長至 20 min。
用途
細胞融合不僅可用于核質關系、基因定位、體細胞的遺傳和發(fā)育等生物學的基礎理論研究，而且在生產實踐上還有重要的應用價值，目前已成功應用于單克隆抗體的制備、新品種的培養(yǎng)、性狀的改良、疾病的治療和潛伏病毒的研究等領域。
材料與儀器
器材：① 天平
② 普通低速離心機
③ 恒溫水浴鍋
④ 普通光學顯微鏡
⑤ 滴管、5 ml 刻度離心管、蓋玻片、載玻片、一次性注射器、燒杯、血細胞計數板
試劑：
① 材料：健康成年雞
② 肝素鈉
③ Alsever 溶液
④ 0.85％ 生理鹽水
⑤ GKN 溶液
⑥ PEG（M，＝4000）（50％）
⑦ 詹納斯綠（Janus green）染液
步驟
PEG 介導的雞血細胞融合的基本過程可分為如下幾步：
（一）試劑配制
（1）Alsever 溶液
葡萄糖 2.05 g，檸檬酸鈉 0.80 g，NaCl 0.42 g，溶于雙蒸水中，定容至 100 ml。
（2）GKN 溶液
NaCl 8 g, KCl 0.40 g, Na2HPO4 · 12H2O 3.77 g, NaH2PO4 · 2H2O 0.78 g，葡萄糖 2 g，酚紅（phenol red）0.01 g，溶于雙蒸水中，定容至 1000 ml。
（3）詹納斯綠染液
稱取 30 mg 詹納斯綠染料，溶于 100 ml 生理鹽水中，混勻，即可得到 0.03％ 的染液。
（4）50％ PEG 溶液
稱取 10 g PEG，151bf／in2（103.4 kPa）高壓滅菌 20 min，待冷卻至 50～60 ℃ 時加入 10 ml 溫熱的 GKN 溶液并混勻。如配制過程中 PEG 發(fā)生凝固，重新加熱使其熔化。用 NaHCO3 調 pH 至 8.0。4 ℃ 保存?zhèn)溆?，臨用前置 37 ℃ 預溫。最好現用現配。
（二）細胞融合
（1）將新鮮的雞血直接注入加有一支肝素鈉的燒杯中，混勻抗凝。
（2）用量筒量取一定量的上述抗凝雞血，加入 Alsever 溶液，配制成 1：4 細胞懸液備用或 4 ℃ 冰箱保存（3～4 d 內可用）。
（3）用 1 只 5 ml 刻度離心管取 0.5～1 ml 上述雞血懸液，加入 0.85％ 生理鹽水至 5 ml，混勻平衡后，800 g 離心 5 min，棄上清液。再按上述條件重復離心 2 次。最后，棄上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，800 g 離心 5 min。
（4）棄上清液，加適量 GKN 溶液，吸管吹打混勻，制成 10％ 細胞懸液。
（5）取以上懸液以血細胞計數器計數，若細胞密度過大，用 GKN 溶液稀釋至（3～4）x107 個/ml（此步也可省略）。
（6）取以上細胞懸液 1 ml 于離心管，或在原離心管中棄去一部分懸液，保留 1 ml 于原離心管中。將離心管放入 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴鍋中預熱。
（7）待溫度恒定后，向上述 1 ml 細胞懸液中緩慢逐滴加入 0.5 ml 預熱的 50％ PEG 溶液（慢慢沿離心管壁流下融合劑），且邊加邊輕播離心管混勻，最后用吸管輕輕吹打混勻。放入水浴鍋中靜置孵育。
（8）細胞融合一段時間（10～20 min）后，加入 GKN 溶液至 5 ml，靜置于水浴鍋中繼續(xù)孵育 20 min 左右。
（9）取出離心管，800 g 離心 5 min，使細胞完-全沉降。棄上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，重懸沉淀，重復離心 1 次。
（10）棄上清液，加入少量（0.5 ml 左右）GKN 溶液，混勻，取少量懸液于載玻片加入詹納斯綠染液，用牙簽攪勻，染色 5 min（也可用吉姆薩染液染色 5～10 min）。蓋上蓋玻片，觀察細胞融合情況并計算融合率。雞血
注意事項
（1）滴加 50％ PEG 時，應緩慢、逐滴加入，其間最好輕彈試管底部，滴加完畢后用滴管充分溫和混勻。
（2）鏡檢觀察時要注意區(qū)分融合細胞與重疊細胞。
（3）在實驗中統計融合率時，要進行多個視野計數，然后進行平均，以使統計更為準確。
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