材料與儀器

SD雄性大鼠
兔抗β- caten in 抗APC 抗體 鼠抗cyclin D1 mAb PV6001兩步法檢測試劑盒 總RNA 提取試劑盒 PCR 反應試劑盒
凝膠成像儀 電泳儀 PCR儀器 槍頭 槍頭盒 移液槍 超凈臺

步驟

1.  大鼠肝癌模型的建立

將二已基亞硝胺（ DENA）的水溶液以70 m g /kg的劑量每周灌胃1次， 15周停藥。有10只大鼠在造模過程中死亡，其余32只分別在喂藥后第1、4、6、8、10、12、14、16周，處死動物，每次處死4 只。每只取不同部位的小塊肝組織，分別置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮凍存。正常對照組8只，不給藥。

2.  wnt1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及cmyc mRNA 的RT-PCR 檢測

引物的設計和合成交由大連寶信生物公司完成，經(jīng)驗證后使用。

擴增wnt1 基因的引物序列為： 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3，擴增產物長度為432 bp，退火溫度為58e 。擴增β-caten in基因的引物序列為： 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，擴增產物長度為375 bp, 退火溫度為58. 2e 。

擴增APC 基因的引物序列為： 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，擴增產物長度為310 bp，退火溫度為60e 。

擴增cy clin D1基因的引物序列為： 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，擴增產物長度為440 bp， 退火溫度為58e 。

擴增cmyc基因的引物序列為： 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，擴增產物長度為186 bp，退火溫度為60. 5e 。

擴增內參照B-actin引物的序列為5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，擴增產物的長度為665 bp， 退火溫度為60e 。

注意事項

1. 采用多聚甲醛來固定大鼠組織時，固定時間避免太久，否則組化盡出假陽性。把固定時間確定下來，固定好后放低濃度酒精里可以放置時間久一點。

2.  對于取出大鼠小塊肝部位，避免肝的重要部位有鑷子的刮痕，以免對實驗后期的觀察產生影響。             

3. 實驗需要進行對照組對比，以免出現(xiàn)假陽性或假陰性結果。

4. 擴增基因序列時，要嚴格按照所設定的溫度進行。

常見問題

1. Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發(fā)生突變，導致信號異?；罨?，就可能誘導癌癥的發(fā)生。

2. 經(jīng)文獻報道，研究人員檢查了超過3500份的癌癥樣本，包括結腸癌、黑色素瘤、肝細胞瘤、脊髓母細胞瘤、消化道腫瘤等，發(fā)現(xiàn)在超過700個癌癥病例中出現(xiàn)β-Catenin的多種突變。Β-Catenin的N端序列可能是其致癌的關鍵位點，這些位點的突變使得β-Catenin在胞內表達失控，導致Wnt信號異常激活，從而誘發(fā)包括結直腸癌、肝母細胞瘤、卵巢癌和前列腺癌等在內的多種癌癥。

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