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蛋白質分離實驗
發(fā)布時間： 2022-12-01 點擊次數： 1004次簡介
蛋白質分離的方法主要有 3 種：SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質、免疫沉淀法分離蛋白質和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質。
原理
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質的基本原理是蛋白質在 SDS 和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵打開，形成帶負電荷的 SDS-蛋白質復合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一種具有三維結構的網狀高分子聚合物，具有分子篩的作用。蛋白質在 PAGE 電泳中向正極遷移，遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結構。SDS 帶有較強的負電荷，不同的蛋白質與之結合后具有相同的荷質比，并具有相似的空間構象，使得 SDS-蛋白質復合物在 PAGE 中的遷移速率只與蛋白質的分子大小相關。免疫沉淀法分離蛋白質的基本原理是是利用特異的抗體從細胞裂解物中分離目的蛋白的一種沉淀方法。該方法首先要制備細胞裂解液，然后將特異性抗體加到細胞裂解液中，4 ℃ 下孵育一定時間后，再加入可以與特異性抗體結合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗體復合物而沉淀。將沉淀下來的抗原-抗體復合物在含有 SDS 和 DTT 的緩沖液中加熱后，使被沉淀的抗原釋放出來，經電泳分離后即可用各種方法檢測。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質是根據蛋白質的兩個一級屬性-等電點和分子質量的特異性，將蛋白質混合物在電荷（等電聚焦，IEF）和分子質量（變性聚丙烯酰胺凝胺電泳，SDS-PAGE）兩個水平上進行分離。2D-PAGE 的第一向電泳是等電聚焦電泳（IEF），蛋白質因所帶凈電荷的不同而被分離開；然后對蛋白質進行第二向電泳-SDS-PAGE，在 SDS-PAGE 中，不同分子質量的蛋白質相互間分離開。由于蛋白質的分子質量和所帶凈電荷是兩個彼此不相關的重要性質，而 2D-PAGE 同時利用了蛋白質間在這兩個性質上的差異分離蛋白質。
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