-
從大規(guī)模裂解物中制備λ噬菌體顆粒實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間： 2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 1176次原理
從大規(guī)模培養(yǎng)物中制備的 λ 噬菌體，可在高鹽存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的辦法從裂解物中回收得到。殘余的細(xì)胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在進(jìn)一步純化之前，建議測(cè)定噬菌體制備物的得率。
材料與儀器
大腸桿菌培養(yǎng)物
氯仿 NaCl 聚乙二醇 SM 胰 DNaseⅠ
Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào) 量筒步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
氯仿，NaCl ( 固體），聚乙二醇（PEG 8000)（每 500 ml 培養(yǎng)物大約用 50 g），SM。
2. 酶和緩沖液
胰 DNase Ⅰ ( 1 mg/ml)，胰 RNase ( 1 mg/ml ) 于 TE 中（pH 7.6 )。
3. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)子
Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)。
4. 專(zhuān)用設(shè)備
量筒（2 L)。
5. 載體和菌株
大腸桿菌培養(yǎng)物，經(jīng) λ 噬菌體感染和裂解。
二、方法
用 PEG 沉淀噬菌體顆粒
1. 將含有 λ 噬菌體的裂解培養(yǎng)物冷卻至室溫，加胰 DNase Ⅰ 和 RNase 至終濃度均為 1 μg/ml，室溫溫育 30 min。
2. 每 500 ml 培養(yǎng)物加入 29.2 g 固體 NaCl（終濃度為 1 mol/L)，攪拌使其溶解。將培養(yǎng)物冰浴 1 h。
再用 PEG 沉淀噬菌體顆粒中，NaCl 的加入促進(jìn)了噬菌體顆粒與細(xì)胞碎片之間的分離，因此是有效沉淀所需的。一些研究人員喜歡在加入 PEG 的同時(shí)加入 NaCl，那樣的話(huà)步驟 3 的離心過(guò)程可被省略。但需要告知的是，只有當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)良好且其在最初裂解培養(yǎng)物中的滴度大于 2X1010 pfu/mI 時(shí)，PEG 和 NaCl 的同時(shí)加入才能有效地沉淀噬菌體顆粒。
3. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 10 min 以去除細(xì)胞碎片，將四份培養(yǎng)物的上清混合置于 2 L 的干凈量筒中。
4. 測(cè)定所收集上清的總體積，然后轉(zhuǎn)移至 2 L 的燒瓶中，加固體 PEG 至終濃度為 10% (m/V，如 500 ml 上清加 50 g PEG)，于室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解 PEG。
5. 將噬菌體/PEG 溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中，于冰水浴冷卻，至少放置 1 h 以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀。
6. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 10 min 以回收沉淀的噬菌體，去上清，將離心管倒過(guò)來(lái)傾斜放置 5 min，以便使剩余液體充分流干。用移液器吸去殘余的液體。
用氯仿抽提細(xì)菌碎片
7. 用一帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于 SM 中（針對(duì)步驟 3 每 500 ml 上清加 8 ml SM)，將離心管傾斜放置，使 SM *覆蓋并浸泡噬菌體沉淀，室溫放置 1 h。
*但溫和地沖洗整個(gè)離心管壁，因?yàn)槭删w沉淀會(huì)黏附在管壁上，尤其當(dāng)離心管比較陳舊有凹痕時(shí)。而如果劇烈地吸取噬菌體，容易造成其尾部的斷裂。
8. 通過(guò)加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的 PEG 和細(xì)胞碎片，溫和振蕩 30 s。4℃，3000 g（4300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 15 min 以分離有機(jī)相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相。
為了測(cè)定得率，用凝膠電泳分析噬菌體懸浮液。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶(hù)，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專(zhuān)注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
-
血清系列
-
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
-
支原體清除
-
細(xì)胞凍存
-
實(shí)驗(yàn)耗材
-
分子試劑
-
細(xì)胞增殖與凋亡
-
Biozellen系列
-
培養(yǎng)基
-
ELISA試劑盒
-
TOYOBO（東洋紡）
-
ZYMO RESEARCH
-
Greiner（格瑞納）
-
IKA（艾卡）
-
化學(xué)發(fā)光底物（ECL）
-
PROSPEC系列
-
Epigentek系列
-
微生物檢測(cè)
-
細(xì)胞生物學(xué)
-
Corning康寧
-
解離試劑
-
細(xì)胞類(lèi)-實(shí)驗(yàn)耗材
-
原代細(xì)胞
-
植物檢測(cè)系列試劑盒
-
SERANA
-
細(xì)胞系
-
生化試劑盒
-
環(huán)境檢測(cè)系列試劑盒（AKEN）
-
類(lèi)器官培養(yǎng)
-
緩沖器和解決方案
-
生物三凝膠基質(zhì)
-
細(xì)胞因子分子
-
生物樣本庫(kù)
