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免疫熒光技術(shù)-間接法

發(fā)布時(shí)間： 2021-10-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1595次

材料與儀器：
抗體
PBS 伊文氏蘭
顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 標(biāo)本固定后，PBS洗滌3x3 分鐘；
2. 滴加一抗，37 ℃40 分鐘或4 ℃過(guò)夜；
3. PBS洗3x3 分鐘；
4. 滴加熒光標(biāo)記二抗37 ℃，40 分鐘；
5. PBS洗3x3 分鐘；
6. 0.1 %伊文氏蘭復(fù)染；
7. PBS洗3x3 分鐘；
8. 緩沖甘油封片，鏡檢。

要點(diǎn)：
1.種屬在進(jìn)行雙重免疫標(biāo)記時(shí)，要選擇來(lái)源于兩種不同種屬動(dòng)物的一抗，如選擇來(lái)源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標(biāo)記的，如抗rabbit或抗mouse二抗， FITC和Tex-Red;
2.孵育時(shí)間和溫度相同的兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后加入相對(duì)應(yīng)的一抗的二抗進(jìn)行孵育，一抗孵育時(shí)間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過(guò)4h,選擇4℃孵育比較好，背景比較清晰，另外孵育時(shí)夏天特別注意室溫溫度；
3.抗體稀釋液通常第一抗體選擇1%牛血清白蛋白進(jìn)行稀釋，第二抗體選擇用0.01mol/L的PBS稀釋。

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