做過(guò) Western-Blot 的童鞋知道，分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍，我待小分子蛋白如初戀。抱怨是沒(méi)用的，想方設(shè)法解決問(wèn)題才是正道。一次又一次的調(diào)整方案，一次又一次的徒勞無(wú)功。在此，總結(jié)了小分子蛋白之路經(jīng)驗(yàn)，供有需求的童鞋參考。

一、提蛋白的過(guò)程在 30 分鐘之內(nèi)完成，提完蛋白立即加入上樣緩沖液煮沸（煮沸的時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，一般 20 分鐘），準(zhǔn)備好蛋白樣品后立即電泳。（小分子蛋白容易形成多聚體，這樣可以大大減少多聚體的形成）。

二、電泳時(shí)，電泳的時(shí)間要足夠長(zhǎng)。習(xí)慣是先用 60-80V 電壓跑完濃縮膠，再以 100-120V 電壓跑分離膠，溴酚藍(lán)電泳至玻璃板底部。伯樂(lè)系列的電泳槽一般電泳 2 個(gè)小時(shí)左右，GE 以及百晶系列的電泳槽要電泳 4 到 5 個(gè)小時(shí)。電泳時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的膠（若用 0.75mm 厚的膠時(shí)要適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間）。

三、轉(zhuǎn)膜時(shí)，盡量用濕轉(zhuǎn)法（半干轉(zhuǎn)也可以，但是容易轉(zhuǎn)過(guò)）。轉(zhuǎn)膜緩沖液中，甲醇濃度要達(dá)到 20%。PVDF 膜，財(cái)大氣粗的土豪可以用 0.22 微米的膜。對(duì)于我們大多數(shù)窮人來(lái)說(shuō)，0.45 微米的膜也是可以的。以下是摸索出來(lái)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間（濕轉(zhuǎn)法，0.45 微米的膜），供大家參考。

四、一抗孵育因?yàn)槎鄶?shù)小分子蛋白的表達(dá)量較少，所以我一般孵育至少 48 個(gè)小時(shí)，甚至孵育 72 個(gè)小時(shí)。以上方法適用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa，則不用 SDS-PAGE 凝 膠電泳（蛋白與 SDS 共遷移，影響分離度，得不到很好的分離效果），應(yīng)該采用 Tris-Tricine 緩沖系統(tǒng)與 Tricine 分離膠。具體操作步驟見(jiàn)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南》338-340 頁(yè)（這本書(shū)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必會(huì)備，若沒(méi)有，可以在孔夫子舊書(shū)市場(chǎng)上買(mǎi)一本）。

需要注意的是，Tricine 電泳時(shí)，蛋白樣品用 Tricine 樣品緩沖液處理，加樣前在 37-40℃沙浴中處理一個(gè)小時(shí)（不要煮沸！不要煮沸！不要煮沸！重要的事情說(shuō)三遍）。內(nèi)槽中加滿陰極緩沖液，外槽中加滿陽(yáng)極緩沖液（千萬(wàn)不要加反了。否則蛋白全部進(jìn)入緩沖液！）。 

最后，祝做小分子蛋白的童鞋實(shí)驗(yàn)之路順利，早日做出滿意的結(jié)果。