siRNA 表達載體的構(gòu)建

siRNA 表達載體構(gòu)建可以：

（1）作為后基因組時代基因功能分析的有力工具；

（2）應(yīng)用于基因組學、細胞信號傳導通路分析；

（3）用于藥物靶點篩選、疾病治療。

實驗方法原理: 

多數(shù)的 siRNA 表達載體依賴三種 RNA 聚合酶 III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的 發(fā)夾 RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家 熟悉的人源和鼠源的 U6 啟動子和人 H1 啟動子。之所以采用 RNA polIII 啟動子是由于它 可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子 RNA，而且它是通過添加一串（3 到 6 個）U 來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購 2 段編碼短發(fā)夾 RNA 序列的 DNA 單鏈，退火， 克隆到相應(yīng)載體的 pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。

實驗材料: 目的基因 

試劑、試劑盒：LB 培養(yǎng)基 

儀器、耗材：離心管、離心機、水浴鍋、漩渦振蕩儀等

一、目的基因的確定 

1. 檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）。 

2. NCBI 查閱。 

3. 搜索引擎輔助：Google搜索引擎。

二 、設(shè)計 siRNA 靶序列

在制備 siRNA 前都需要單獨設(shè)計 siRNA 序列。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細胞,*的 siRNAs 是 21-23 個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈 RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段 dsRNA。siRNA 的序列專一性要求非常嚴謹，與靶 mRNA 之間一個堿基錯配都 會顯著削弱基因沉默的效果。

1. 選擇 siRNA 靶位點 

從轉(zhuǎn)錄 AUG 起始密碼子開始，搜尋下游 AA 序列，記錄跟每個 AA 3’端相鄰的 19 個核苷酸作為候選的 siRNA 靶位點。有研究結(jié)果顯示 GC 含量在 30%-50%左右的 siRNA 要比那 些 GC 含量偏高的更為有效。Tuschl 等建議在設(shè)計 siRNA 時不要針對 5'和 3'端的非編碼區(qū) （untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些 UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響 siRNP 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA 從而影響 siRNA 的效果。

2. 序列同源性分析

將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進行比較,排除那些和其他 編碼序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST（ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的 siRNA 都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個目的基因，一般要選擇 3-5 個靶位點來設(shè)計 siRNA。 通常來說，每個目標序列設(shè)計 3-4 對 siRNAs，選擇*的進行后續(xù)研究。

3. 設(shè)計陰性對照

一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。

三、表達載體的選用

1. 化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到 siRNA 后再導入細胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA 進入細胞后容易被降解；進入細胞 siRNA 在細胞內(nèi)的 RNAi 效應(yīng)持續(xù)時間短。針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導的 siRNA 體內(nèi)表達。 該方法的基本思路是：將 siRNA 對應(yīng)的 DNA 雙鏈模板序列克隆入載體的 RNA 聚合酶 III 的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達所需的 siRNA 分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作 RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。

2. 通過質(zhì)粒表達 siRNAs 大都是用 Pol III 啟動子啟動編碼 shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用 Pol III 啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成 RNA，遇到 4—5 個連續(xù)的 U 即終止，非常精確。當這種帶有 Pol III 啟動子和 shRNA 模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達 siRNA 的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過 siRNA 表達質(zhì)粒的選擇標記，siRNA 載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備 siRNA 的成本。

3. 帶有抗生素標記的 siRNA 表達載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒 可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達數(shù)星期甚至更久。同時 RNAi-Ready 表達載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高 siRNA 表達載體對宿主細胞的侵染性,*克服某些細胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙，是實現(xiàn)哺乳動物細胞 siRNAs 瞬時表達與穩(wěn)定表達的理想工具。

四、合成模板

1. 合成編碼 shRNA 的 DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有 RNA PolyIII 聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點，同時兩端分別設(shè)計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。

2. 95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。

五、連接與轉(zhuǎn)化

1. 將 100 μl 感受態(tài)細胞于冰上解凍。

2. 取 5 μl 連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置 30 分鐘。

3. 將管放入預(yù)加溫到 42℃的水浴中，熱激 90 秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻 1~2 分鐘。

4. 每管中加 700 μl LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng) 1 小時，進行復(fù)蘇。

5. 室溫 4000 rpm 離心 5 分鐘，棄去上清后，用剩余 100 μl 培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含抗性的 LB 瓊脂平板表面。注意：細胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細胞的效率進行調(diào)整。

6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。

7. 倒置平皿，于 37℃培養(yǎng)，12~16 小時后可出現(xiàn)菌落。

六、PCR 鑒定和測序鑒定

在插入編碼 shRNA 的 DNA 雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計鑒定 PCR 引物，擴增片段在 100-200bp 之間。

注意事項： 

1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的 AUG 起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其 3’端的 19 個堿基序列，作為潛在的 siRNA 靶位點。有研究結(jié)果顯示 GC 含量在 30%—50%左右 的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更為有效。 Tuschl 等建議在設(shè)計 siRNA 時不要針對 5’和 3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions， UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些 UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響 siRNP 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA 從而影響 siRNA 的效果。

2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST 同源的序列。 

3. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的 siRNA，以找到*的 siRNA 序列。

4. 一個完整的 siRNA 實驗應(yīng)該有負對照，作為負對照的 siRNA 應(yīng)該和選中的 siRNA 序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂， 同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計劃合成 siRNA，那么可以直接提供以 AA 打頭的 21 個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的 siRNA 是以 3’dTdT 結(jié)尾，如果要 UU 結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU 結(jié)尾和 dTdT 結(jié)尾的 siRNA 在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。

其他：

siRNA 操作成功要點

1. 對每個基因設(shè)計并檢測兩到四個 siRNA 序列為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的 AA 序列。記錄每個 AA 3’端 19 個核苷酸作為潛在 siRNA 靶位點。潛在靶位點需通過 GENBANK 數(shù)據(jù)庫的 BLAST 分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA 應(yīng)根據(jù) mRNA 低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計。 

2. 選擇低 GC 含量的 siRNA 

研究發(fā)現(xiàn) GC 含量在40-55%的 siRNA 比55%以上的活性高。

3. 純化體外轉(zhuǎn)錄 siRNA 

在轉(zhuǎn)染前要確認 siRNA 的大小和純度。為得到高純度的 siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫(siRNA 體外合成試劑盒中已包括純化柱保證 siRNA 純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的 RNA 通常需要跑膠電泳純化(即 PAGE 膠純化)。

4. 避免 RNA 酶污染 

微量的 RNA 酶將導致 siRNA 實驗失敗。由于實驗環(huán)境中 RNA 酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)， 所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受 RNA 酶污染非常重要。如除 RNA 酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除 RNA 酶。

5. 健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。 為了優(yōu)化實驗，推薦用 50 代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。 

6. 避免適用抗生素推薦從細胞種植到轉(zhuǎn)染后 72 小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在 siRNA 轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。Zeta Life 公司推出的專門針對 RNA 轉(zhuǎn)染的試劑Zeta Life Advanced DNA RNA Transfection Reagent（Zeta Life高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑）

7. 選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 siRNA 針對靶細胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對 siRNA 實驗的成功至關(guān)重要。siRNA 實驗要求選擇適合轉(zhuǎn)小的 RNA 的轉(zhuǎn)染試劑(目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒 DNA，而非小的 RNA 分子，宿主范圍大小也不同)。Zeta Life 公司的 Zeta Life Advanced DNA RNA Transfection Reagent（Zeta Life高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑）都是專門針對轉(zhuǎn) siRNA 優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是理想選擇。

8. 通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA)，轉(zhuǎn)染 48 小時后統(tǒng)計對照蛋白或 mRNA 相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的 siRNA 將導致細胞毒性以至死亡。

9. 通過陰性對照 siRNA 排除非特異性影響 合適的陰性對照可通過打亂活性 siRNA 的核苷酸順序設(shè)計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10. 通過標記 siRNA 來優(yōu)化實驗 

熒光標記的 siRNA 能用來分析 siRNA 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的 siRNA 還可用作 siRNA 胞內(nèi)定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了 siRNA 的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。