細(xì)胞狀態(tài)很差，常常出現(xiàn)的現(xiàn)象是：細(xì)胞邊緣不清晰、細(xì)胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點(diǎn)很多、細(xì)胞碎片多（細(xì)胞凋亡后的細(xì)胞碎片）、單個(gè)細(xì)胞內(nèi)有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細(xì)胞出現(xiàn)老化，也就是細(xì)胞比較扁平、增殖減緩、細(xì)胞核體積增大、細(xì)胞突觸變多，此時(shí)觀察到的細(xì)胞狀態(tài)也是不正常的。

▲ 圖1：背景很臟；

▲圖2：有較多小黑點(diǎn)

因此細(xì)胞狀態(tài)差只是對(duì)這些現(xiàn)象的一種籠統(tǒng)說(shuō)法。

究其根本，細(xì)胞狀態(tài)變差主要是由于兩種原因：

1 細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)條件不夠

2 細(xì)胞被污染了

今天我們將深入分析影響細(xì)胞狀態(tài)的這些原因。

一、營(yíng)養(yǎng)條件不夠

細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)條件不夠時(shí)，就需要從培養(yǎng)基方面考慮。

（1）血清

由于血清來(lái)源于動(dòng)物，且含有細(xì)胞培養(yǎng)中所需的各種營(yíng)養(yǎng)（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等），這奠定了血清是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基礎(chǔ)普遍的試劑的基礎(chǔ)。

市面上的牛血清產(chǎn)品名稱(chēng)雖然五花八門(mén)，但根據(jù)其不同的特性，追其根本，大致可分為以下四種。根據(jù)牛的取血年齡可以區(qū)分：

胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心臟穿刺采血得來(lái)的血清。

國(guó)產(chǎn)胎牛血清（并無(wú)明確定義，但通常用此命名）指的是出生4-6小時(shí)，且未進(jìn)行哺乳（unsuckled）進(jìn)食的新生牛，有時(shí)還稱(chēng)作國(guó)產(chǎn)新生牛血清。 

新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)NBCS，或稱(chēng)小牛血清）指的是出生14天-3個(gè)月進(jìn)行取血的牛血清。

成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)ABS）指的是取血時(shí)牛齡通常超過(guò)12個(gè)月的牛血清。

以上取血牛齡的差異主要是受當(dāng)?shù)貒?guó)家畜牧業(yè)的發(fā)展及法規(guī)限制影響，因?yàn)榕Ｑ酁樾竽翗I(yè)副產(chǎn)業(yè)，并未有專(zhuān)門(mén)為取血而養(yǎng)的牛。

這幾種不同牛齡血清所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。常規(guī)來(lái)說(shuō)，牛齡越小的牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)效果越好。但是也需要根據(jù)自己培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)選擇最合適的血清。

同一血清不同批號(hào)內(nèi)的成分和營(yíng)養(yǎng)組成比例會(huì)不同，因?yàn)檠鍋?lái)源于動(dòng)物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。每個(gè)批號(hào)的組分和百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)測(cè)試來(lái)找尋合適的血清批次。當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要更換血清時(shí)，細(xì)胞需要有一段適應(yīng)期。因此，要根據(jù)自己的細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行合適的選擇。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基

培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，除了血清還需要添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混合成為*培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是成分確定且知其確切含量的，可以補(bǔ)充血清中缺乏的營(yíng)養(yǎng)元素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般含有氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、含碳物質(zhì)，蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)元素，每種成分對(duì)于細(xì)胞存活、代謝等功能都有不同影響，不同細(xì)胞系需要的成分含量也不同，因此市面上會(huì)存在各類(lèi)培養(yǎng)基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基礎(chǔ)培養(yǎng)基也需要根據(jù)自己培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行更合適的選擇。自行配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，需要注意是否需另外添加營(yíng)養(yǎng)物或必需物至培養(yǎng)基中（如：碳酸氫鈉）并調(diào)整pH值。使用不適合的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)但特性會(huì)改變。培養(yǎng)基中常用的酚紅（pH指示劑）本身有微弱雌激素作用，會(huì)刺激具有雌激素受器的細(xì)胞生長(zhǎng)。

如果您都是按照操規(guī)范保存培養(yǎng)基和培養(yǎng)細(xì)胞，那么我們繼續(xù)考慮污染情況。

二、細(xì)胞被污染

污染情況通常從以下幾部分考慮。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、細(xì)菌、支原體、黑膠蟲(chóng)、病毒、細(xì)胞交叉污染等。

這些污染都是有其自有特征的噢~

（1）真菌污染

這類(lèi)微生物外觀類(lèi)似棉絮狀的漂浮物，在顯微鏡下可觀察到菌絲體，污染早期不會(huì)使培養(yǎng)基變黃。

（2）酵母菌污染

顯微鏡下常見(jiàn)成串的珠狀物形態(tài)呈卵形，大約比細(xì)胞小5~10倍，當(dāng)其進(jìn)行出芽生殖時(shí)，會(huì)聚集成連體結(jié)構(gòu)；爆發(fā)污染嚴(yán)重時(shí)，會(huì)造成培養(yǎng)基pH值改變，不易除去。

（3）細(xì)菌污染

培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)變成黃色或白色渾濁，細(xì)胞停止生長(zhǎng)甚至死亡；有些狀況下培養(yǎng)基顏色改變不明顯但細(xì)胞形態(tài)會(huì)變異（出現(xiàn)多角，多核狀況）、細(xì)胞不附著，顯微鏡觀察背景有大量黑點(diǎn)。

（4）支原體污染

支原體種類(lèi)較多，常以寄生或腐生營(yíng)養(yǎng)方式生長(zhǎng)，廣泛存在于環(huán)境之中，是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常見(jiàn)污染，經(jīng)常來(lái)源于實(shí)驗(yàn)人員（支原體常見(jiàn)于人體皮膚、呼吸道、生殖道和消化道）、動(dòng)物源血清及胰酶、消毒不*的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通過(guò)一般標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)濾方法，0.22μm過(guò)濾膜。支原體增長(zhǎng)速度相較于細(xì)菌比較緩慢，污染初期（輕微）培養(yǎng)基可能依然清澈不會(huì)變黃，所以輕微污染時(shí)不容易用常規(guī)方法發(fā)現(xiàn)（細(xì)胞外觀觀察或是DNA染色法）確認(rèn)。

▲ 左圖：感染前；                                                ▲ 右圖：感染后

支原體污染不但會(huì)緩慢改變細(xì)胞形態(tài)、增殖、基因表達(dá)、蛋白合成及代謝反應(yīng)，它攜帶的DNA/RNA與蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌體實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

（5）黑膠蟲(chóng)污染

目前科學(xué)界對(duì)黑膠蟲(chóng)并無(wú)定論，認(rèn)為是不明沉淀現(xiàn)象或多種未知生物污染現(xiàn)象的通稱(chēng)。在高倍率顯微鏡頭下，可觀察到各式形狀的小黑點(diǎn)（卵圓狀、球狀、桿狀等）、活躍的布朗運(yùn)動(dòng)及明顯游動(dòng)現(xiàn)象，部分黑膠蟲(chóng)具有細(xì)胞毒性，可引起細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩或裂解凋亡。

▲ 黑膠蟲(chóng)污染

（6）病毒污染

病毒感染可能來(lái)自宿主動(dòng)物細(xì)胞或病人，病毒感染及傳播具有細(xì)胞專(zhuān)一性，在細(xì)胞培養(yǎng)污染物中是相對(duì)較難檢測(cè)的。然而一旦細(xì)胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細(xì)胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴(yán)重時(shí)會(huì)在單層細(xì)胞上觀察到局部破損空斑。

▲ 左圖：Before infection；右圖：After 24 hours infectiond

（7）細(xì)胞交叉污染

曾有文獻(xiàn)報(bào)道統(tǒng)計(jì)，目前使用的細(xì)胞株大約有15~20%不是科學(xué)家們所認(rèn)為的細(xì)胞，而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，細(xì)胞來(lái)源和細(xì)胞株身份鑒定檢測(cè)觀念普遍缺乏。細(xì)胞株的交叉污染，常在不經(jīng)意的實(shí)驗(yàn)疏失（不同細(xì)胞株分盤(pán)時(shí)，共享一瓶培養(yǎng)基、槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細(xì)胞株之間的混合污染，或是實(shí)驗(yàn)操作人員錄入錯(cuò)誤細(xì)胞株名稱(chēng)，繼代時(shí)的培養(yǎng)皿，冷凍細(xì)胞時(shí)的凍存管）中發(fā)生，而造成錯(cuò)誤后續(xù)數(shù)據(jù)搜集；目前大部分的科學(xué)期刊都已有“細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)論文發(fā)表前，均需附上細(xì)胞鑒定報(bào)告”的規(guī)定（可查閱：文章發(fā)表前要求提供細(xì)胞鑒定的雜志），以此保證數(shù)據(jù)來(lái)源的正確性。

目前常用的細(xì)胞身份驗(yàn)證的方式包括：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、同功酶分析、染色體組分型、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前國(guó)際細(xì)胞庫(kù)（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于細(xì)胞株身份鑒定方法。

三、細(xì)胞老化了

無(wú)論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見(jiàn)的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。

老化細(xì)胞不會(huì)立即死亡，但其基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，如果細(xì)胞老化現(xiàn)象嚴(yán)重，建議從種子庫(kù)或工作庫(kù)重新復(fù)蘇細(xì)胞。

圖1： 實(shí)心箭頭指示的是發(fā)生細(xì)胞老化的HEK293細(xì)胞，SA-β-gal染色陽(yáng)性，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細(xì)胞。

圖2： 被染上藍(lán)色的是發(fā)生老化的MSC細(xì)胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細(xì)胞。

由圖片可以看出老化細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平。

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